微生物实验用菌种的保存方法

                                                          微生物实验用菌种的保存方法

                                                        圣宾仪器科技（上海）有限公司

微生物实验用菌种是进行新产品研发和生产质量控制的标准物质。为了保证微生物实验的准确灵敏和人员及环境的卫生安全，特制定以下规定：

　　1. 菌种采集。实验室用菌种一是到国家法定机构采购，二是购买ATCC菌种，三是科研中菌种交流。不管是哪种来源，均由公司统一采集。采集中严格按照规范执行。要求包装可靠，采集迅速，不泄漏不污染。保证菌种合格和环境安全。采集中要有菌种传代标识。

　　2.菌种的活化：购买的标准菌种必须要求是冻干粉，科研中菌种交流可以为斜面或液体。

　　菌种的活化最好是在非选择性琼脂培养基上，除非特殊情况或特别推荐，一般不用液体培养基。具体使用培养基的情况如下表，详细菌种使用方法见附表：

　　 方法：①胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)，非选择性羊血琼脂，PCA或营养琼脂，35℃正常环境培养24-48小时。②非选择性羊血琼脂，35℃正常环境培养24-48小时。③巧克力琼脂平板，35℃5-10%CO2环境培养24-48小时。④ CDC厌氧血琼脂35℃厌氧培养48-72小时；部分专性厌氧菌能需要5-7天，才能充分生长；对于梭菌，以下新鲜培养基也可选用：营养琼脂，TSA琼脂，PCA琼脂，需培养48-96小时。⑤沙堡氏葡萄糖Emmons琼脂25-28℃培养3-7天；也可用PDA琼脂。⑥巧克力琼脂平板，35℃微需氧环境培养48-72小时。⑦ 改良罗氏琼脂或Middlebrook琼脂，35℃5-10%CO2或正常环境培养7天。⑧ 缓冲活性碳酵母提取物琼脂，35℃正常环境培养3-5天。⑨巧克力琼脂平板，35℃5-10%CO2环境培养48小时。⑩ 先用脑心浸出液肉汤或TSB培养基35℃增菌培养18-24小时，再划线至TSA琼脂35℃正常环境培养24-48小时。11、先接种于MRS肉汤35℃增菌培养24-48小时，再划线接种至含羊血的哥伦比亚CNA培养基35℃5%CO2环境培养24-48小时。12、 PDA琼脂45℃正常环境培养48-72小时。13、 先接种于10B精氨酸肉汤，作系列梯度稀释35℃正常培养至培养基变成粉红色，接入A-8琼脂。

　　3.菌种保存。所有菌种均由实验室专人(双人双锁)保存于专用冰箱或其它保存方式。要建立菌种登记台帐，详细记录菌种采集、保管、制备、使用、处置情况；每一种菌种一定要有本公司的检测鉴定报告（具体的的鉴定方法见ATCC提供的菌种证书方法）；具体菌种保存方法如下：

　　3.1 干粉菌种：购买的干粉菌种保存于2-8℃冰箱中，可保存3-5年。

　　3.2 斜面菌种或液体菌种：

　　3.2.1 液氮罐保存方法：用于第一代菌种的长期保存，每种菌种保存5管。

　　（1）准备用于液氮保藏的安瓿管或菌种保存管(塑料)，要求能耐受温度突然变化而不致破裂，因此，需要采用硼硅酸盐玻璃制造的安瓿管，安瓿管的大小通常使用75×10mm的，或能容1．2mm液体的。

　　（2）加保护剂与灭菌保存细菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的细胞时，则将空安瓿管塞上棉塞， 121℃灭菌15分钟：若作保存霉菌菌丝体用则需在安瓿管内预先加入保护剂如10％的甘油蒸馏水溶液或10％二甲亚砜蒸馏水溶液，加入量以能浸没以后加入的菌落圆块为限，而后再用121℃灭菌15分钟。

　　（3）接入菌种：将菌种用10％的甘油蒸馏水溶液制成菌悬液，装入已灭菌的安瓿管；霉菌菌丝体则可用灭菌打孔器，从平板内切取菌落圆块，放入含有保护剂的安瓿管内，然后用火焰熔封。浸入水中检查有无漏洞。

　　（4）冻结再将已封口的安瓿管以每分钟下降1℃的慢速冻结至-30℃。若细胞急剧冷冻，则在细胞内会形成冰的结晶，因而降低存活率。

　　（5）保藏经冻结至-30℃的安瓿管立即放入液氮冷冻保藏器的小圆筒内，然后再将小圆筒放入液氮保藏器内。液氮保藏器内的气相为-150℃，液态氮内为-196℃。

　　（6）恢复培养保藏的菌种需要用时，将安瓿管取出，立即放入38-40℃的水浴中进行急剧解冻，直到全部融化为止。再打开安瓿管，将内容物移入适宜的培养基上培养。

　　此法除适宜于一般微生物的保藏外，对一些用冷冻干燥法都难以保存的微生物如支原体、衣原体、氢细菌、难以形成孢子的霉菌、噬菌体及动物细胞均可长期保藏，而且性状不变异。

　3.2.2 液体石蜡保存法：将液体石蜡分装于三角烧瓶内，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎， 121℃灭菌30分钟，然后放在40℃温箱中，使水汽蒸发掉，备用。将需要保藏的菌种，在最适宜的斜面培养基中培养，使得到健壮的菌体或孢子。用灭菌吸管吸取灭菌的液体石蜡，注入已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1cm为准，使菌种与空气隔绝。将试管直立，置低温或室温下保存（有的微生物在室温下比冰箱中保存的时间还要长）。

　　大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、假单胞杆菌属、沙门氏菌属、副伤寒沙门氏菌、李斯特氏菌属、蜡样芽胞杆菌、八叠球菌、短芽孢杆菌、大肠杆菌HB101、大肠杆菌DH5a、猪肺疫、禽多杀性巴氏杆菌（禽霍乱）、猪丹毒、大肠杆菌O157、大肠菌群、产气肠杆菌、志贺氏菌属；接种于半固体培养基上，36±1℃培养18-24小时，加入无菌石蜡油覆盖，保存于2-8℃冰箱或室温中。可保存1-2年。注：副溶血性弧菌接种于含盐的半固体培养基上，36±1℃培养18-24小时，加入无菌石蜡油覆盖，保存于室温

　　产气荚膜梭菌、梭杆菌属、拟杆菌属等厌氧菌、厌氧消化链球菌：接种于CDC厌氧菌琼脂中，培养18-24小时，加入无菌石蜡油覆盖，保存于2-8℃冰箱或室温中。可保存1-2年。酵母菌：接种于YPD培养基中，28℃培养24-48小时，加入无菌石蜡油覆盖，保存于2-8℃冰箱或室温中。可保存1-2年。霉菌、白色念珠球菌：接种于PDA培养基中，28℃培养24-48小时，加入无菌石蜡油覆盖，保存于2-8℃冰箱或室温中。可保存1-2年。链球菌属：接种于羊血琼脂，36±1℃培养24-48小时，加入无菌石蜡油覆盖，保存于2-8℃冰箱或室温中。可保存1-2年。副嗜血杆菌、淋病奈瑟菌(需5-10%CO2环境)、脑膜炎奈瑟菌(需5-10%CO2环境)、流感嗜血杆菌接种于巧克力琼脂，36±1℃培养24-48小时，加入无菌石蜡油覆盖，保存于2-8℃冰箱或室温中。可保存1-2年。分枝杆菌属：接种于改良罗氏琼脂或Middlebrook琼脂36±1℃培养7天，加入无菌石蜡油覆盖，保存于2-8℃冰箱或室温中。可保存1-2年。

　　4.菌种制备。菌种制备按照批准的制备计划执行。制备中要按规范要求操作，同时做好工作记录。记录内容包括：菌种名称，传代标识、制备数量。在制备容器上作出明确表示。具体菌种制备方法如下：可以麦氏比浊管计数每ml菌液的菌数

　　1）大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、假单胞杆菌属、沙门氏菌属、副伤寒沙门氏菌、李斯特氏菌属、蜡样芽胞杆菌、八叠球菌、短芽孢杆菌、大肠杆菌HB101、大肠杆菌DH5a、猪肺疫、禽多杀性巴氏杆菌（禽霍乱）、猪丹毒、大肠杆菌O157、大肠菌群、产气肠杆菌、志贺氏菌属；把各种细菌菌种划线接种于营养琼脂平板上，36±1℃培养18-24小时，挑取单菌落接种于10ml营养肉汤中，36±1℃培养18-24小时，计数出每ml营养肉汤中的细菌数。把菌液保存于2-8℃，此菌液可保存7-10天，每10天重新挑取单菌落接种于10ml营养肉汤中， 36±1℃培养18-24小时，用生理盐水稀释到10-7，计数出10-6/0.1ml、10-7/0.1ml营养肉汤中的细菌数。

　　2）产气荚膜梭菌、梭杆菌属、拟杆菌属等厌氧菌、厌氧消化链球菌等厌氧菌直接接种于10ml液体硫乙醇酸盐培养基中，36±1℃培养18-24小时，计数出每ml液体硫乙醇酸盐培养基中的细菌数（在厌氧条件下培养）。

　　3）酵母菌、霉菌和白色念珠球菌：接种于PDA培养基中，28℃培养24-48小时，挑取单菌落接种于10ml葡萄糖蛋白胨培养基中，28℃培养24-48小时，用YPD琼脂计数出每ml葡萄糖蛋白胨培养基中的菌落。把菌液保存于2-8℃，此菌液可保存7-10天，每10天重新挑取单菌落接种于10ml葡萄糖蛋白胨培养基中，28℃培养24-48小时，用生理盐水稀释到10-7，计数出10-6/0.1ml、10-7/0.1ml葡萄糖蛋白胨培养基中的菌数。

　　4）链球菌属：接种于脑心浸液中36±1℃培养18-24小时，计数出每ml脑心浸液中的细菌数。把菌液保存于2-8℃，此菌液可保存7-10天，每10天重新挑取单菌落接种于10ml脑心浸液中， 36±1℃培养18-24小时，用生理盐水稀释到10-7，计数出10-6/0.1ml、10-7/0.1ml脑心浸液中的细菌数。

　　5）副嗜血杆菌、淋病奈瑟菌(需5-10%CO2环境)、脑膜炎奈瑟菌(需5-10%CO2环境)、流感嗜血杆菌接种于巧克力琼脂，36±1℃培养18-24小时，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释，经比浊后制成每1ml含菌数约相当于100～1000cfu的菌悬液。

　　6) 分枝杆菌属：接种于改良罗氏琼脂或Middlebrook琼脂36±1℃培养7天，用0.9%无菌氯化钠溶液将上述增菌培养后的质控菌种的新鲜培养物制成1.0~3.0×103CFU/ml的菌悬液，作为工作菌液。

　　5．菌种的标识和使用期限：标识：菌种代数的计算为干粉菌种为第0代，转接一次斜面加一代。具体标识为：例单增李斯特氏菌ATCC19114第0代，表识为单增李斯特氏菌ATCC19114-0，第一代表识为单增李斯特氏菌ATCC19114-1；第一代有12支，则表识为单增李斯特氏菌ATCC19114-1-1、……、单增李斯特氏菌ATCC19114-1-12；使用期限：传代次数不得超过5代，菌种已变异或生化鉴定不符合；

　　6.菌种使用。菌种管理员，每月领取1支第一代(或第二代、第三代)菌种。再根据以上方法制备工作菌液，分发给实际使用者，实际使用者领用前应充分考虑重复实验的需要。同一实验要选择同代菌种，保证实验的可比性。领用菌种要详细登记，领用人要签字，并注明领用时间。

　　7.菌种处理。实验完毕的菌种遗留物和污染物应严格按照三废处理规定执行。提供给外部的菌种必须经公司总经理批准，按规定要求包装运输。严禁私自对外提供菌种。

                                                                                                                                          本篇转载至实验之家